09 Apr Neinvazivno preimplantacijsko genetsko testiranje na aneuploidiju niPGT-A
Neinvazivno preimplantacijsko genetsko testiranje na aneuploidiju (niPGT-A): prva brazilska beba
José Gonçalves Franco Jr., Laura Diniz Vagnini, i João Batista Alcantara Oliveira
Nedavno se pojavila nova tehnologija poznata kao neinvazivno preimplantacijsko genetičko testiranje na aneuploidiju (niPGT-A), koristeći DNK bez ćelija prisutnu u istrošenom mediju kulture ljudskih blastocista. Za razliku od PGT-A, u kojem se koriste samo ćelije trofektoderma, niPGT-A odražava stanje ploidnosti ovih ćelija i unutrašnje ćelijske mase, sugerirajući da ova nova tehnologija može biti manje sklona greškama, jer je pouzdanija od invazivnog testa. Cilj ove studije bio je prijaviti prvu pojavu porođaja nakon niPGT-A u Brazilu.
Nakon nekoliko godina korištenja preimplantacijskog genetskog testiranja za aneuploidiju (PGT-A), ostaju mnoge zabrinutosti, poput rizika zbog invazivnog djelovanja i poteškoća u ispravnom tumačenju mozaicizma, što može dovesti do grešaka u analizi lažno pozitivnih i – negativni rezultati (Greco et al., 2015; Franco, 2015; 2019; Kang et al., 2016; Gleicher et al., 2015; 2016; 2018; Paulson, 2017; Rosenwaks 2 et al., unM et al. 2017; 2019).
Nedavno se pojavila nova tehnologija poznata kao neinvazivno preimplantacijsko genetsko testiranje na aneuploidiju (niPGT-A), koristeći DNK bez ćelija prisutne u istrošenom mediju kulture ljudskih blastocista (Fang et al., 2019; Farra et al., 2018; Feichtinger et al., 2017; Franco, 2019; Franco et al., 2020; Ho et al., 2018; Huang et al., 2017; Olcha et al., 2020; Shamonki i et al., 2nig et al., 2 nig. , 2020; Xu et al., 2016). Za razliku od PGT-A, u kojem se koriste samo ćelije trofektoderma, niPGT-A odražava stanje ploidnosti ovih ćelija i unutrašnje ćelijske mase, sugerirajući da ova nova tehnologija može biti manje sklona greškama, jer je pouzdanija od invazivnog testa.
Cilj ove studije bio je prijaviti prvu pojavu porođaja nakon niPGT-A u Brazilu.
Par (J.S., 37-godišnja žena i B.S., njen 36-godišnji suprug) primljen je 2019. godine na prve medicinske konsultacije. Imale su 8-godišnju istoriju sekundarne neplodnosti zbog tuboperitonealnog faktora i endometrioze.
-Predstavila je anamnezu vanmaterične trudnoće koja je liječena lijevom salpingooferektomijom.
testovi:
Broj antralnih folikula: 11; Koncentracija anti-Müllerovog hormona u serumu: 1,44 ng/mL; Indeks tjelesne mase (BMI): 26,84 kg/m2.
Laparoskopija: normalna materica, liza adhezija, uklanjanje ostatka lijeve cijevi, mjesta diseminirane endometrioze u karlici. Desna cijev je podvrgnuta prethodnoj histeroskopiji: normalna maternična šupljina.
Hormonsko mjerenje: TSH = 1,34 µIU/mL; Slobodni T4 = 0,71 ng/dL; Prolaktin = 20,7 ng/mL.
Kariotip: 46,XX
– Nije iznio relevantne podatke u svojoj kliničkoj anamnezi.
testovi:
Spermogram: koncentracija: 21×106/mL, pokretljivost: 68% progresivna, morfologija (prema MSOME): Normalni oblici: 0; oblici sa vakuolama koje zauzimaju >50 nuklearnog područja: 46%.
Indeks fragmentacije DNK sperme: 11%.
Indeks protaminacije: 28% (nizak).
Kariotip: 46,XY.
IVF tretman
Pacijentkinja je podvrgnuta kontrolisanoj stimulaciji jajnika prema protokolu dugog GnRH agonista (Lupron®, Abbott Laboratories, Brazil) i korištenjem rekombinantnog FSH (GonalF®, Merck Serono, Italija) i rekombinantnog FSH+LH (Pergoveris®, Merck Serono, Italija) za 08. dana. Kada su dominantni folikuli dosegli 18 mm, pokrenuto je konačno sazrijevanje oocita upotrebom jedne doze rekombinantnog hCG (rhCG) od 250 µg (Ovidrel®, Merck Serono, Italija).
Uzimanje oocita obavljeno je 36h nakon hCG-a i rezultiralo je sakupljanjem 11 kompleksa kumulus-oocita. Na dan aspiracije, uzorak sjemena je pokazao 65% progresivne pokretljivosti i koncentraciju od 35×106/mL i 61% progresivne pokretljivosti. Nakon jednog sata izvlačenja, sve oocite su denudirane upotrebom hijaluronidaze 40IU, tokom 2-3 minuta. Korona ćelije su potpuno uklonjene pomoću 150 µm stripera kako bi se kontaminacija pacijenata svela na minimum. Identificirano je jedanaest MII oocita i inseminirano putem intracitoplazmatske morfološki odabrane injekcije sperme (IMSI), kao što je prethodno opisano (Oliveira et al., 2011.). U 18 sati nakon ICSI, morfološka procjena je pokazala 8 oplođenih oocita sa dva pronukleusa i ekstruziju drugog polarnog tijela. Drugog dana prebačena su dva embriona sa najboljim rezultatom.
Prekomjerni embrioni su kultivisani do stadijuma blastociste, na 37ºC u atmosferi koja sadrži 7% CO2 i 5% O2. Ukupno 3 embriona stigla su u stadijum blastociste i kriokonzervirana. Dva od njih su podvrgnuta krioprezervaciji nakon što je njihov odgovarajući istrošeni medij sakupljen za genetsku analizu (niPGT-A).
Nakon 14 dana transfera, nivo ß-hCG u serumu je bio negativan. Zbog negativnog rezultata odlučili smo da prenesemo smrznute embrije analizirane niPGT-A.
Neinvazivno preimplantacijsko genetsko testiranje na aneuploidiju (niPGT-A)
IVF Laboratorija
Ukupno 5 prekomjernih embriona je kultivirano od 3. do 5. dana.Trećeg dana, cijepani embriji su ponovo procijenjeni za potpuno uklanjanje kumulusnih ćelija tako što su ih ispirali pojedinačno tri puta kako bi se uklonile sve preostale pričvršćene granulozne ćelije koje okružuju embrije. Nakon toga, embrioni su prebačeni u pojedinačne jažice koje su sadržavale 20 µL svježeg medija u GPS® posuđe (SP38-010) pod uljem i kultivirane sve dok nisu dostigli fazu blastociste 5. dana.
Sakupljanje uzoraka
Sav potrošeni medij iz blastocista, ostavljen u svakoj mikrokapljici GPS® posude, ubačen je u prethodno identificiranu sterilnu PCR epruvetu od 0,2 mL koja sadrži 5 µL pufera za lizu korištenjem individualno rastegnutih pipeta. PCR epruvete su čuvane na -20ºC najmanje 24 sata prije slanja u laboratoriju na genetsku procjenu. Uzorak (20 µL) podloge iz jedne pojedinačne jažice (GPS® posuda), u kojoj nisu uzgajani embriji, također je sakupljen i korišten kao kontrola. Tokom prikupljanja medijuma, sve procedure su rađene u sterilnim uslovima u kabinetu za laminarni protok uz upotrebu maske, kape, rukavica i sterilnih materijala.
Amplifikacija cijelog genoma i sekvenciranje DNK
Slobodna DNK koju svaka blastocista izlučuje u medijum kulture je umnožena korišćenjem NICS kompleta za pripremu uzorka (Yikon Genomics) zasnovanog na MALBAC tehnologiji. Nakon cjelokupne amplifikacije genoma, DNK je izmjerena pomoću Qubit 2.0 fluorometra (Thermo Fisher Scientific) i podvrgnuta sekvenciranju sljedeće generacije (NGS) koristeći Illumina MiSeq® platformu.
Analiza podataka
Softver ChromGo (Yikon Genomics, Kina) korišten je za analizu podataka sekvenciranja i prijavljivanje hromozomskih abnormalnosti. Ovaj softver omogućava procjenu cijelih hromozoma, analizu kratkih i dugih krakova svakog hromozoma, te otkrivanje delecije ili duplikacije >10Mb, osim što omogućava određivanje spola embrija i prisutnosti mozaicizma.
niPGT-A rezultati :
Blastocista 1(M31): 46,XX
Blastocista 2(M30): 46,XY,-15q(q13.1→q24.1,~44M,×1,
mj, ~50%). Mozaična parcijalna monosomija ili delecijski hromozom 15 u ≈50% ćelija.
Transfer smrznutih embrija
Endometrij je pripremljen dnevnom oralnom primjenom 6 mg estradiol valerata (Cicloprimogyna®, Schering, São Paulo, Brazil) počevši od prvog dana menstruacije.14. dana korištenja, transvaginalni ultrazvuk pokazao je debljinu endometrijuma od 7,6 mm i trostruku liniju. Od tada je pacijentkinja počela svakodnevno intravaginalno davanje progesterona (Utrogestan®, Besins Healthcare, Brazil). Petog dana primjene progesterona, dvije blastociste kojima je niPGT-A dijagnosticirao mozaik 46,XX i 46,XY su zagrijane i prenesene. Nakon 14 dana, kvantifikacija beta-hCG je izmjerena na 427,75 mIU/mL.
Evolucija trudnoće
-USG 6 sedmica evolucije: Tema 6-nedjeljna blizanačka trudnoća. Embrion I, prisutni otkucaji srca fetusa. Embrion II, prisutni otkucaji srca fetusa.
-USG 7 nedelja: zaustavljen razvoj jednog od embriona.
-12 sedmica:
USG: Nuhalna translucencija 1,65 mm.
Biohemijska evaluacija za trizomije: nizak rizik.
Fetalni spol: ženski spol.
-04.08.2020:39 nedelja: rođenje zdrave djevojčice sa 3.540 kg i 50 cm. Apgar indeks 1. min: 9/ 5. minuta – Klinička procjena novorođenčeta: nema promjena.
Komentari
Nedavno su Xu et al. (2016) opisao je mogućnost neinvazivnog hromozomskog skrininga (niPGT-A) dobivanjem i sekvenciranjem slobodne DNK koju embriji oslobađaju u mediju kulture (bez potrebe za biopsijom embrija), stvarajući novu, neagresivnu i elegantnu perspektivu za preimplantacijsku genetsku dijagnozu. Ovaj opis slučaja dodaje nekoliko nedavno objavljenih članaka koji opisuju rođenje zdrave djece iz euploidnih blastocista odabranih od strane niPGT-A u ICSI programima, kao i za parove s genetskim promjenama (Xu et al., 2016; Fang et al., 2019) . niPGT-A, koji uključuje samo sakupljanje medija za kulturu embriona, može se, barem potencijalno, koristiti u svim ICSI ciklusima.
Osnovni problem je mogućnost da niPGT-A prevaziđe probleme svojstvene klasičnom PGT-A. Potreba za biopsijama, potencijalno oštećenje trofektoderme i proces implantacije, pored toga što zahtijevaju embriologe sa značajnom obukom i iskustvom za obavljanje manipulacije embrionima, među pitanjima su u vezi s PGT-A. S druge strane, ostaju upiti koji se tiču budućih rizika od invazivnog djelovanja ćelija uklonjenih tokom biopsije. Kod životinja, neki podaci sugeriraju da embrionalne biopsije mogu biti povezane s promjenama u fetalnoj neuralnoj cijevi ili razvoju nadbubrežne žlijezde (Wu et al., 2014; Zeng et al., 2013). Takođe, PGT-A određuje genetsko stanje embriona analizom nekih trofektodermnih ćelija koje, u stvari, ne nastaju embrionom, već postaju deo potpornih struktura, kao što su placenta i membrane. Bez sumnje, bilo bi teško precizno procijeniti prisustvo mozaicizma koji generiše značajne nivoe lažno pozitivnih rezultata i na taj način uzrokuje realnu mogućnost odbacivanja zdravih embriona.
Trenutna saznanja o izvoru slobodne DNK u medijumima kulture embriona su ograničena. Međutim, ne možemo poreći da niPGT-A može detektovati genomsku DNK, ne samo iz ćelija trofektoderma, već i iz unutrašnje ćelijske mase (ICM) blastociste. Stoga bi niPGT-A mogao pružiti preciznije informacije o embrionalnoj ploidiji. Ipak, precizan doprinos svake od ovih grupa ćelija konačnoj koncentraciji slobodne DNK je izazov za procjenu.
Apoptoza je, barem u teoriji, implicirana kao primarni izvor slobodne DNK prikupljene za izvršenje niPGT-A. Procenat i brzina eliminacije abnormalnih ćelija (samokorekcija) mogu se povezati sa ploidnim karakteristikama embriona. Bolton et al. (2016) pokazali su u mozaičkom modelu miša da aneuploidne i euploidne ćelije iz ICM-a, kao i iz trofektoderme, prolaze kroz apoptozu. Ovi istraživači su takođe pokazali da je veći procenat ICM ćelija postao apoptotičan u poređenju sa ćelijama trofektoderma, bez obzira da li su bile aneuploidne (41,4% prema 3,3%, respektivno) ili euploidne (19,5% naspram 0,6%).
Neke studije su takođe prijavile bolje rezultate sa niPGT-A. Huang et al. (2019), koristeći embrije poslane na istraživanje, uporedio je rezultate niPGT-A i PGT-A. Lažno pozitivni rezultati bili su značajno rjeđi kod niPGT-A (20%) nego kod PGT-A (50%) kada su oba upoređena sa ukupnim skriningom na blastociste (kontrola). U međuvremenu, uočena je 100% saglasnost između niPGT-A i genetske analize donirane blastociste u pogledu dijagnoze euploidnog embriona.
Druga multicentrična studija (Vagnini et al., 2020) pronašla je sličan rezultat. Ova kohortna studija uključila je ukupno 37 blastocista, vitrificiranih 5. dana, koje su prethodno bilepsirane za PGT-A i predstavile su dijagnozu aneuploidije. Rezultati statusa ploidnosti dobijeni za medijum kulture i cio embrion su upoređeni kako bi se utvrdila tačnost niPGT-A za skrining hromozomskih abnormalnosti u svakom embrionu. Kada se porede niPGT-A i rezultati sekvenciranja cijelog embriona, pozitivna prediktivna vrijednost (PPV) bila je 93,5%, a FPR 6,5%. S druge strane, upoređujući cijeli embrion i rezultate PGT-A, PPV je bio 78,4%, a FPR 21,6%. I niPGT-A i PGT-A su imali negativnu prediktivnu vrijednost (NPV) od 100% i lažno negativnu stopu (FNR) od 0%. Dakle, kada je sekvenciranje DNK iz celih embrionalnih ćelija korišćeno kao zlatni standard, FPR niPGT-A bio je 3,32 puta manji od onog dobijenog sa PGT-A.
niPGT-A je metoda koja izbjegava traumu biopsije trofektoderma i čini se da daje preciznije rezultate u pogledu statusa ploidnosti cijelog embrija. Stoga, niPGT-A treba smatrati testom izbora za genetsku selekciju embrija.
Informacije o članku
JBRA Assist Reprod. 2020. oktobar-dec; 24(4): 517–520.
doi: 10.5935/1518-0557.20200074
PMCID: PMC7558898
PMID: 32897670
José Gonçalves Franco Jr.,1,2 Laura Diniz Vagnini,2 Claudia Guilhermino Petersen,1,2 Adriana Renzi,2 Maria C.T. Canas,2 Bruna Petersen,1,2 Juliana Ricci,1 Andreia Nicoletti,1 Camila Zamara,1 Felipe Dieamant,1,2 i João Batista Alcantara Oliveira1,2
1 Centar za ljudsku reprodukciju – Prof. Franco Jr., Ribeirão Preto, Brazil.
2 Paulista centar za dijagnozu, istraživanje i obuku, Ribeirão Preto, Brazil.
Autori za dopisivanje: José Gonçalves Franco Junior Centar za ljudsku reprodukciju Prof. Franco Jr Ribeirão Preto/SP, Brazil. E-pošta: rb.moc.hrc@hrc
Primljeno 10. aprila 2020.; Prihvaćeno 27. avgusta 2020.
Obavijest o autorskim pravima
Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uslovima licence Creative Commons Attribution License, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju na bilo kom mediju, pod uslovom da je originalno djelo pravilno citirano.
Članci iz JBRA potpomognute reprodukcije su dati ovdje ljubaznošću Brazilskog društva za potpomognutu reprodukciju
Izvor
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7558898/
Dostupno je kod nas ekperimentalno u Španiji, pogledajte video 👇👇
Španija